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当前位置: 首页 > 在线留言 > 【求助】慢病毒质粒构建为什么克隆辣么小
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  • question 载体构建慢病毒质粒,目的片段1400bp,之前转化用TOP10感受态,16小时长出的克隆比针尖大不了多少,完全不是以前大小适中、饱满的样子,如果再延长时间,原有克隆不会继续长大,而会在其周围新长出更小的一片克隆,小提酶切、测序均含有目的片段,可问题是用Qiagen中提浓度特别低,只有300,本次导入stabl3里面,还是长的针尖大小,而实验室其他人用这个载体构建的质粒,目前还都没有测序,但克隆的样子大小很正常。我不知道为什么我的克隆长的这么奇怪,那效率低是不是也跟这有关系,这个浓度完全没办法转染啊,但是操作过程没有什么问题,想请教各位大神,这是什么原因,我怎样才能提高质粒产量,谢了">【求助】慢病毒质粒构建为什么克隆辣么小

    • answer

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      mosocwj
      慢病毒载体一般都比较大。以plenti 6.3 V5 DEST来说,空载体就接近10kb. 如果利用gateway技术插入1400片段没有明显改变载体大小。但是对于仅仅含有1个细菌DNA复制起始子的载体,这个大小已经有些难以承受。这是为什么Life开发了stabl3系列菌株,以降低细菌重组频率,提高对长片段的容错能力,提高大载体在细胞内存在的稳定性。但是这并没有根本上有所改观所遇到的困难。因此,在菌落生长过程中,表现为菌落生长速度很慢。当然有些案例是,所表达的载体对细菌造成一定的毒性,影响了细菌生长。在菌落长大的过程中,有很多细菌,因为丢失了部分载体片段,因而在后期会生长出很多卫星小菌落。大多为丢失了部分载体DNA的重组子。这是为什么,在测序验证的时候,常常测不出结果。
      想要提高阳性菌落数量,可以针对这些问题,做些调整。比如:降低菌落培养的温度。当你使用30C 或28C进行菌落培养时候,细菌分裂生长减缓,但是带来的同时是,基因重组频率也下降了,因此,你得到的克隆阳性率会提高。此外,对于中抽或大抽,降低温度,也会减少载体DNA的突变。

      ......


      非常感谢,之前就很纠结那些卫星小菌落
    • answer 慢病毒载体一般都比较大。以plenti 6.3 V5 DEST来说,空载体就接近10kb. 如果利用gateway技术插入1400片段没有明显改变载体大小。但是对于仅仅含有1个细菌DNA复制起始子的载体,这个大小已经有些难以承受。这是为什么Life开发了stabl3系列菌株,以降低细菌重组频率,提高对长片段的容错能力,提高大载体在细胞内存在的稳定性。但是这并没有根本上有所改观所遇到的困难。因此,在菌落生长过程中,表现为菌落生长速度很慢。当然有些案例是,所表达的载体对细菌造成一定的毒性,影响了细菌生长。在菌落长大的过程中,有很多细菌,因为丢失了部分载体片段,因而在后期会生长出很多卫星小菌落。大多为丢失了部分载体DNA的重组子。这是为什么,在测序验证的时候,常常测不出结果。
      想要提高阳性菌落数量,可以针对这些问题,做些调整。比如:降低菌落培养的温度。当你使用30C 或28C进行菌落培养时候,细菌分裂生长减缓,但是带来的同时是,基因重组频率也下降了,因此,你得到的克隆阳性率会提高。此外,对于中抽或大抽,降低温度,也会减少载体DNA的突变。
    • answer
      kangaroo0513
      lenti系列载体转化stbl3很多长出来都是小小的,大抽质粒之前先做3-4个克隆的小抽,然后选取产量较大的菌冻存。一般我5ml菌液能提出400ng/ul*35ul的质粒,400以下的就不留了,好一些的能上800ng/ul。

      那你这个浓度还是蛮高的,我用stabl3转化的小提只有60-80ng/ul*60ul,现在导入DH5A,小提浓度倒是上来了,500*60,酶切验证也没问题,打算用这个了
    • answer lenti系列载体转化stbl3很多长出来都是小小的,大抽质粒之前先做3-4个克隆的小抽,然后选取产量较大的菌冻存。一般我5ml菌液能提出400ng/ul*35ul的质粒,400以下的就不留了,好一些的能上800ng/ul。
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