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  • question 试剂盒的方法。">DNA纯化的方法(不用试剂盒)

    • answer DNA纯化
      首先利用琼胶电泳将不同分子量的DNA片段分开,将某一特定分子量区域的琼胶切下,利用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出并浓缩.
      实验材料
      ( 6X gel-loading dye:15% Ficoll 400,0.25% bromophenol blue,
      0.25% xylene cyanol
      ( 紫外光箱
      ( 下列试剂来自GeneAid公司所售的Gel/PCR Fragment Extraction Kit:
      * DF Buffer
      * Wash Buffer
      * Elution Buffer:10mM Tris-HCl(pH8.5)
      * DF Column
      * 2ml Collection Tube
      实验步骤
      A.将欲分离之DNA混合物以0.7%琼胶电泳分离.
      B.电泳后,将琼胶置於紫外光箱上观察,把含有欲纯化之DNA片段的琼胶部位切下.
      C.将步骤B的琼胶以蓝色微量吸管尽可能戳碎.
      D.加入500ml DF buffer,55oC作用10分钟,每2-3分钟摇晃数次,直至琼胶完全溶解.
      E.将步骤D琼胶溶液全部吸入DF Column,并套上Collection Tube(收集过滤液).
      F.8000rpm离心1分钟,将过滤液倒掉.
      G.加入500ml Wash Buffer,8000rpm离心1分钟,过滤液倒掉.
      H.14000rpm离心2分钟.
      I.将DF Column转移至上另一乾净的微量离心管.加入15ml Elution Buffer,室温静置2分钟.
      J.14000rpm离心2分钟,微量离心管内之液体即为纯化的DNA片段.
      K.取0.5ml纯化的DNA加入4.5mlDDW及1ml 6x DNA loading dye,跑0.7%琼胶电泳,与marker比较,估计DNA的浓度.
    • answer DNA用等体积的酚/氯仿抽提一次,重复此步骤,加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液后混匀,零下20摄氏度沉淀30 min后12000 r/min离心10 min,沉淀用75%乙醇洗涤一次,12000 r/min离心5 min,弃上清,沉淀自然干燥后溶于20~40微升去离子水中或者0.5 mol/L pH8.0的TE中,加入1 uL RNase(20 ug/mL),37摄氏度温育30 min。
      酚/氯仿依照体积比1:1配制,加入RNase后不需要将其去除。
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